Vaccini autoreplicanti: “la cellula ricevente può reagire incorporando un eccesso di molecole di RNA nelle vescicole extracellulari (EV) e queste possono rilasciarsi ed entrare nelle cellule vicine e distanti, dove il saRNA associato all’EV può iniziare un nuovo ciclo replicativo”, dott. Maurizio Federico

Mette in guardia dai pericoli dei vaccini autoreplicanti il nuovo lavoro del dott. Maurizio Federico, “Il potenziale della diffusione dell’RNA autoamplificante mediata dalle vescicole extracellulari e un modo per mitigarlo”.

“La tecnologia basata su RNA autoamplificanti (saRNA) rappresenta l’ultima frontiera nell’utilizzo dell’RNA sintetico in vaccinologia. Tipicamente, i saRNA sono costituiti da molecole di RNA a filamento positivo di origine virale (quasi esclusivamente da alfavirus) in cui le sequenze delle proteine ​​strutturali vengono sostituite con la sequenza di lettura aperta (Open Reading Frame) che codifica per l’antigene di interesse”, spiega.

“Per la somministrazione in vivo, vengono complessati con nanoparticelle lipidiche (LNP), proprio come gli attuali vaccini contro il COVID-19 basati su RNA messaggero sintetico (mRNA). Data la loro capacità di auto-amplificarsi all’interno della cellula, livelli intracellulari ottimali dell’antigene immunogenico possono essere raggiunti somministrando quantità inferiori di molecole di saRNA rispetto ai vaccini a base di mRNA.

Tuttavia, l’eccessivo accumulo intracellulare di saRNA può rappresentare un inconveniente rilevante poiché, come già descritto nelle cellule infettate da alfavirus, la cellula ricevente può reagire incorporando un eccesso di molecole di RNA nelle vescicole extracellulari (EV). Queste EV possono rilasciarsi ed entrare nelle cellule vicine e distanti, dove il saRNA associato all’EV può iniziare un nuovo ciclo replicativo. Questo meccanismo potrebbe portare a una diffusione indesiderata e non necessaria di saRNA in tutto il corpo, ponendo rilevanti problemi di sicurezza.

La tecnologia basata sui saRNA si basa sull’ingegneria genetica del genoma degli alfavirus, ovvero dei virus a RNA a filamento positivo, in particolare il virus dell’encefalite equina venezuelana, il virus della foresta di Semliki (SFV) e il virus Sindbis [14]. All’ingresso nella cellula, le molecole di saRNA possono amplificarsi esprimendo livelli piuttosto elevati del gene di interesse, il che è determinante, in molti casi, per indurre una forte immunità antigene-specifica.
Nel genoma degli alfavirus, le proteine ​​replicative non strutturali sono codificate da sequenze situate all’estremità 5′, mentre le sequenze all’estremità 3′ codificano le proteine ​​strutturali. L’amplificazione dei saRNA, che si sovrappone al ciclo replicativo degli alfavirus [15], inizia con la traduzione delle proteine ​​non strutturali nsP1-P4. Formano un complesso poliproteico che, in seguito a parziale scissione, sintetizza i filamenti complementari di RNA negativi che fungono da stampo per generare messaggeri (m)RNA sia genomici che sub-genomici. Questi ultimi sono specificamente dedicati alla produzione dell’antigene di interesse (Figura 1).

Le funzioni di ciascuna delle quattro proteine ​​non strutturali sono state studiate in modo approfondito [16]. NsP1 è un enzima di capping che ancora il complesso replicasi virale alle membrane cellulari. NsP2 ha una funzione elicasica, un’attività proteasica ed è coinvolta nel confezionamento dell’RNA virale. NsP3 interagisce con diverse proteine ​​delle cellule ospiti e la sua inattivazione riduce drasticamente l’efficienza di replicazione del genoma e l’espressione dell’RNA sub-genomico, influenzando così l’idoneità virale. Infine, nsP4 ha attività di RNA polimerasi RNA-dipendente (RDRP). Per produrre l’immunogeno desiderato, il genoma dell’alfavirus viene ingegnerizzato in modo che i frame di lettura aperti (OFL) che codificano per le proteine ​​strutturali vengano sostituiti con sequenze specifiche per il gene di interesse, ovvero quelle di Spike di SARS-CoV-2 nel caso dei vaccini COVID-19 basati su saRNA. In questo modo, il gene di interesse viene tradotto nella fase tardiva del ciclo replicativo da RNA sub-genomici la cui espressione è regolata da un promotore sub-genomico interno.
Il vantaggio più evidente del saRNA rispetto alla tecnologia basata sull’mRNA è rappresentato dalla minore quantità di molecole di RNA da somministrare per ottenere una risposta immunitaria comparabile. Ad esempio, livelli di risposta immunitaria simili a quelli generati dall’inoculazione nei topi di un vaccino a mRNA sono stati ottenuti con una dose di saRNA oltre 60 volte inferiore [17]. Nello studio clinico di fase 3, l’inoculazione di 5 µg di RNA equivalenti di saRNA ha prodotto effetti immunogenici di intensità simile a quelli indotti da 30 µg di un vaccino a mRNA [4]. Da un punto di vista biologico, la differenza più evidente è che, mentre l’mRNA artificiale, una volta penetrato nella cellula, può persistere, supportato dalla riadenilazione indotta da TENT5A [18], o degradarsi gradualmente, il saRNA può riprodursi e accumularsi all’interno della cellula bersaglio.

Il destino intracellulare del saRNA e il suo caricamento nelle vescicole extracellulari

La caratteristica biologica più rilevante delle molecole di saRNA consiste nella loro capacità di replicarsi una volta internalizzate dalle cellule bersaglio. I prodotti finali del ciclo replicativo sono molecole di RNA a filamento positivo, a lunghezza intera, stabilizzate da un cap 5′ e poliadenilate all’estremità 3′, insieme a mRNA sub-genomici che, in seguito a poliadenilazione, diventano stampi per la produzione dell’antigene di interesse. A differenza del ciclo replicativo del virus parentale, in cui l’RNA neosintetizzato a lunghezza intera si assembla con le proteine ​​virali strutturali neosintetizzate per formare la progenie virale, ci si aspetta che il saRNA neosintetizzato a lunghezza intera si accumuli intracellularmente resistendo alla rapida degradazione intracellulare. I dati della letteratura aiutano ad anticipare il destino delle molecole di saRNA neosintetizzate. In particolare, risultati rilevanti sono stati ottenuti considerando i sofisticati meccanismi che le cellule attivano per rimuovere l’eccesso di molecole estranee, in particolare il sistema corpo multivescicolare/esosomi [19,20].
Tutte le cellule rilasciano costitutivamente vescicole di varie dimensioni, riconoscendo diverse biogenesi [21]. Le vescicole extracellulari (EV) rilasciate dalle cellule sane sono generalmente distinte in microvescicole (50-1000 nm) ed esosomi (50-200 nm). Sia le microvescicole (chiamate anche ectosomi) che gli esosomi sono vescicole a doppio strato lipidico. Le prime vengono staccate dalla membrana plasmatica, mentre i secondi hanno origine intracellulare dall’invaginazione verso l’interno delle membrane degli endosomi. Questo processo induce la formazione di vescicole intraluminali (ILV), che diventano parte dei corpi multivescicolari (MVB). Possono essere trasportate verso i lisosomi per la degradazione o verso la membrana plasmatica, con cui si fondono, rilasciando così il loro contenuto nell’ambiente extracellulare sotto forma di esosomi.
In origine, si pensava che le vescicole extraluminali fossero sacchi della spazzatura attraverso i quali le cellule espellono i loro rifiuti. Oggi, è ampiamente accettato che le vescicole extraluminali siano anche componenti chiave della rete di comunicazione intercellulare. Incorporano mRNA, microRNA (miRNA), DNA e proteine, che possono essere funzionali nelle cellule bersaglio [22]. Grazie alla loro stabilità nei fluidi biologici, le vescicole extraluminali possono circolare nell’organismo e la loro interazione con le cellule bersaglio può portare alla loro internalizzazione. È mediata da una vasta gamma di meccanismi, tra cui il legame a specifici recettori cellulari e la fusione con la membrana plasmatica, seguita dal rilascio del carico di esosomi direttamente nel citoplasma, micropinocitosi, fagocitosi ed endocitosi mediate da clatrina, caveolina o zattere lipidiche.
Per quanto riguarda la loro composizione molecolare, alcune proteine ​​delle vescicole extracellulari sono specifiche di un tipo cellulare, mentre altre sono parti invariabili delle vescicole extracellulari, indipendentemente dalla cellula di origine. Le proteine ​​tipiche presenti nelle microvescicole sono CD40, selectine, integrine e proteine ​​del citoscheletro. D’altra parte, gli esosomi sono arricchiti con prodotti coinvolti nella formazione di MVB (ad es. Alix, TSG101), nel trasporto e nella fusione di membrana (ad es. annessine, flotilline, GTPasi), nell’adesione (ad es. integrine), nelle tetraspanine (ad es. CD9, CD63, CD81, CD82) e nella presentazione dell’antigene (molecole MHC di classe I e II).
Gli esosomi possono trasportare RNA sia corti che lunghi. Oltre a mRNA e miRNA, negli esosomi sono state trovate altre specie di RNA, come RNA virali, Y-RNA, frammenti di tRNA, RNA mitocondriali, piccoli RNA nucleari, piccoli RNA nucleolari, RNA interagenti con piwi e lunghi RNA non codificanti [23]. I meccanismi che regolano il caricamento specifico di specie di RNA negli esosomi sono solo parzialmente noti. Il caricamento di RNA negli esosomi avviene attraverso meccanismi attivi o passivi. Nel primo contesto, le proteine ​​leganti l’RNA (RBP) svolgono un ruolo chiave nello smistamento delle molecole di RNA negli esosomi [24,25]. È stato identificato un breve motivo nucleotidico che regola lo smistamento dell’RNA negli esosomi attraverso il legame con l’onnipresente RNP-A2B1 nucleare eterogeneo [26]. Successivamente, è stata rilevata una breve sequenza nucleotidica alternativa come motivo di legame per il rilascio di miRNA mediato da hnRNP Q negli esosomi rilasciati dagli epatociti [27]. Insieme, queste sequenze fanno parte dei cosiddetti “esomotif”, che svolgono un ruolo essenziale nel caricamento attivo di RNA negli esosomi [28].
D’altra parte, gli RNA possono essere caricati negli esosomi extracellulari (EV) attraverso meccanismi passivi guidati dall’elevata concentrazione intracellulare di uno specifico RNA [29]. Questo potrebbe essere il caso di molecole di saRNA neosintetizzate a lunghezza intera, il cui accumulo intracellulare dovrebbe essere elevato quanto quello successivo a un’infezione virale acuta. 4. EV come veicoli di propagazione del genoma degli alfavirus: il potenziale della diffusione di saRNA associata agli EV

Studi in vitro e in vivo hanno dimostrato la diffusione del genoma degli alfavirus attraverso gli EV. In dettaglio, è stato riportato che sia i genomi del virus Semliki Forest che del virus Sindbis, difettosi per l’espressione delle proteine ​​del capside, possono propagarsi sia in cellule di mammifero che di insetto attraverso gli EV [19]. Questi genomi difettosi si propagano in presenza e in assenza della coespressione delle rispettive proteine ​​Spike. È stato dimostrato che gli EV che emergono dalle cellule che esprimono i genomi virali mutati incorporano l’RNA virale a filamento positivo, competente per la replicazione, e sono infettivi in ​​vivo, dove si diffondono con maggiore efficienza nei polmoni. Conclusioni simili sono state tratte analizzando i surnatanti di cellule epiteliali infettate da un altro alfavirus, ovvero il virus Chikungunya [20]. Sulla base di queste coerenti evidenze sperimentali, sembra più che plausibile che eventi simili si verifichino nelle cellule in cui penetrano i saRNA (Figura 2). Gli EV che fuoriescono da queste cellule possono penetrare in cellule e tessuti vicini e distanti, e la diffusione degli EV caricati con saRNA può portare a un’espansione di tipo virale. La diffusione del saRNA mediata dagli EV potrebbe anche essere favorita dal caricamento diretto negli esosomi di molecole di LNP-saRNA che sfuggono alla degradazione endosomiale, come descritto per gli mRNA che esprimono sia eritropoietina che VEGF-A [30,31].

L’invaginazione verso l’interno delle membrane degli endosomi. Questo processo induce la formazione di vescicole intraluminali (ILV), che diventano parte dei corpi multivescicolari (MVB). Possono essere trasportate verso i lisosomi per la degradazione o verso la membrana plasmatica, con cui si fondono, rilasciando così il loro contenuto nell’ambiente extracellulare sotto forma di esosomi.
In origine, si pensava che le vescicole extraluminali fossero sacchi della spazzatura attraverso i quali le cellule espellono i loro rifiuti. Oggi, è ampiamente accettato che le vescicole extraluminali siano anche componenti chiave della rete di comunicazione intercellulare. Incorporano mRNA, microRNA (miRNA), DNA e proteine, che possono essere funzionali nelle cellule bersaglio [22]. Grazie alla loro stabilità nei fluidi biologici, le vescicole extraluminali possono circolare nell’organismo e la loro interazione con le cellule bersaglio può portare alla loro internalizzazione. È mediata da una vasta gamma di meccanismi, tra cui il legame a specifici recettori cellulari e la fusione con la membrana plasmatica, seguita dal rilascio del carico di esosomi direttamente nel citoplasma, micropinocitosi, fagocitosi ed endocitosi mediate da clatrina, caveolina o zattere lipidiche.
Per quanto riguarda la loro composizione molecolare, alcune proteine ​​delle vescicole extracellulari sono specifiche di un tipo cellulare, mentre altre sono parti invariabili delle vescicole extracellulari, indipendentemente dalla cellula di origine. Le proteine ​​tipiche presenti nelle microvescicole sono CD40, selectine, integrine e proteine ​​del citoscheletro. D’altra parte, gli esosomi sono arricchiti con prodotti coinvolti nella formazione di MVB (ad es. Alix, TSG101), nel trasporto e nella fusione di membrana (ad es. annessine, flotilline, GTPasi), nell’adesione (ad es. integrine), nelle tetraspanine (ad es. CD9, CD63, CD81, CD82) e nella presentazione dell’antigene (molecole MHC di classe I e II).
Gli esosomi possono trasportare RNA sia corti che lunghi. Oltre a mRNA e miRNA, negli esosomi sono state trovate altre specie di RNA, come RNA virali, Y-RNA, frammenti di tRNA, RNA mitocondriali, piccoli RNA nucleari, piccoli RNA nucleolari, RNA interagenti con piwi e lunghi RNA non codificanti [23]. I meccanismi che regolano il caricamento specifico di specie di RNA negli esosomi sono solo parzialmente noti. Il caricamento di RNA negli esosomi avviene attraverso meccanismi attivi o passivi. Nel primo contesto, le proteine ​​leganti l’RNA (RBP) svolgono un ruolo chiave nello smistamento delle molecole di RNA negli esosomi [24,25]. È stato identificato un breve motivo nucleotidico che regola lo smistamento dell’RNA negli esosomi attraverso il legame con l’onnipresente RNP-A2B1 nucleare eterogeneo [26]. Successivamente, è stata rilevata una breve sequenza nucleotidica alternativa come motivo di legame per il rilascio di miRNA mediato da hnRNP Q negli esosomi rilasciati dagli epatociti [27]. Insieme, queste sequenze fanno parte dei cosiddetti “esomotif”, che svolgono un ruolo essenziale nel caricamento attivo di RNA negli esosomi [28].
D’altra parte, gli RNA possono essere caricati negli esosomi extracellulari (EV) attraverso meccanismi passivi guidati dall’elevata concentrazione intracellulare di uno specifico RNA [29]. Questo potrebbe essere il caso di molecole di saRNA neosintetizzate a lunghezza intera, il cui accumulo intracellulare dovrebbe essere elevato quanto quello successivo a un’infezione virale acuta. 4. EV come veicoli di propagazione del genoma degli alfavirus: il potenziale della diffusione di saRNA associata agli EV

Studi in vitro e in vivo hanno dimostrato la diffusione del genoma degli alfavirus attraverso gli EV. In dettaglio, è stato riportato che sia i genomi del virus Semliki Forest che del virus Sindbis, difettosi per l’espressione delle proteine ​​del capside, possono propagarsi sia in cellule di mammifero che di insetto attraverso gli EV [19]. Questi genomi difettosi si propagano in presenza e in assenza della coespressione delle rispettive proteine ​​Spike. È stato dimostrato che gli EV che emergono dalle cellule che esprimono i genomi virali mutati incorporano l’RNA virale a filamento positivo, competente per la replicazione, e sono infettivi in ​​vivo, dove si diffondono con maggiore efficienza nei polmoni. Conclusioni simili sono state tratte analizzando i surnatanti di cellule epiteliali infettate da un altro alfavirus, ovvero il virus Chikungunya [20]. Sulla base di queste coerenti evidenze sperimentali, sembra più che plausibile che eventi simili si verifichino nelle cellule in cui penetrano i saRNA (Figura 2). Gli EV che fuoriescono da queste cellule possono penetrare in cellule e tessuti vicini e distanti, e la diffusione degli EV caricati con saRNA può portare a un’espansione di tipo virale. La diffusione del saRNA mediata dagli EV potrebbe anche essere favorita dal caricamento diretto negli esosomi di molecole di LNP-saRNA che sfuggono alla degradazione endosomiale, come descritto per gli mRNA che esprimono sia eritropoietina che VEGF-A [30,31].

Sebbene questi meccanismi possano essere in qualche modo vantaggiosi per quanto riguarda l’immunogenicità desiderata, possono essere considerati processi praticamente fuori bersaglio. Infatti, a differenza della maggior parte delle specie virali, gli EV possono entrare nelle cellule di qualsiasi tessuto/organo, dati i loro molteplici meccanismi di ingresso cellulare.
In questo scenario, l’unico ostacolo alla diffusione degli EV del saRNA sarebbe la risposta immunitaria adattativa indotta contro gli antigeni espressi dal saRNA.
Tuttavia, sia la risposta immunitaria umorale che quella cellulare richiedono giorni per svilupparsi in modo efficiente, mentre si prevede che il ciclo di replicazione del saRNA si completi in poche ore e gli EV possano diffondersi in pochi minuti.
Ulteriori risultati di studi sulla biodistribuzione supportano l’idea che il saRNA possa avere un potenziale replicativo in vivo. Una singola iniezione intramuscolare di saRNA esprimente la glicoproteina della rabbia nei ratti ha portato alla distribuzione del vaccino nei polmoni, nel fegato e nella milza entro due giorni. Significativamente, il carico di saRNA rilevato nei polmoni è aumentato di oltre cento volte al quindicesimo giorno successivo all’iniezione. Forti aumenti dei livelli di saRNA sono stati documentati anche nel fegato e nella milza otto giorni dopo l’inoculazione [32].
In un altro studio sulla biodistribuzione, le quantità di saRNA esprimente l’emoagglutinina del virus dell’influenza aviaria rilevate nella milza dei topi iniettati sono aumentate dal quinto al settimo giorno dopo la somministrazione intramuscolare [33]. Nel complesso, questi risultati corroborano fortemente le precedenti evidenze ottenute con genomi difettosi dei virus SFV e Sindbis.
Le conseguenze attese della diffusione del saRNA dipendono principalmente dall’attività biologica del gene di interesse espresso. Il caso della proteina SARS-CoV-2 stabilizzata a lunghezza intera richiede alcune considerazioni specifiche. In primo luogo, la presenza protratta di Spike, principalmente conseguenza della persistenza dell’mRNA del vaccino, è stata documentata nei vaccinati [34,35], suggerendo che la risposta immunitaria non può eliminare rapidamente le cellule che esprimono la proteina Spike di SARS-CoV-2. In secondo luogo, è stato suggerito che la proteina Spike di SARS-CoV-2 si associ agli esosomi [36,37]. In tal caso, si dovrebbe indagare se gli esosomi che esprimono Spike possano essere facilitati nell’ingresso e nel rilascio di molecole di saRNA nelle cellule che esprimono ACE2, e quali siano le conseguenze. Infine, e probabilmente più importante, l’effetto dell’espressione della proteina Spike di SARS-CoV-2 diffusa nell’organismo dovrebbe essere valutato in termini di tossicità complessiva derivante dal legame con ACE2, nonché di ulteriori bersagli molecolari [38], che portano a effetti indesiderati tra cui risposte infiammatorie, disregolazione immunitaria e autoimmunità [39,40,41,42]. In ogni caso, una caratteristica peculiare dei saRNA è la loro potenziale capacità di diffondersi nell’organismo. Pertanto, la ricerca di un metodo per mitigare/inibire la loro diffusione incontrollata appare ampiamente auspicabile.

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Bibliografia

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